Den naturligt forekommende eller eksperimentelt inducerede udskiftning af en eller flere aminosyrer i et protein med et andet. Hvis en funktionelt ækvivalent aminosyre substitueres, kan proteinet bevare vildtypeaktivitet. Substitution kan også mindske eller eliminere proteinfunktionen. Eksperimentelt induceret substitution bruges ofte til at studere enzymaktiviteter og bindingsstedegenskaber.